Longtemps considérée comme abondantes voire illimitées, les ressources naturelles (végétaux, animaux terrestres et marins, eau) sont aujourd’hui perçues comme un facteur limitant dont la qualité est menacée. La gestion rationnelle des ressources naturelles est devenue une des principales préoccupations pour assurer la qualité de la vie sur notre planète et le développement économique durable de nos sociétés. Les ressources naturelles sont particulièrement vulnérables en zone méditerranéenne face aux nombreuses pressions anthropiques, telles que la surexploitation (besoins croissants), la pollution, l’eutrophisation, la forte croissance et/ou variation saisonnière démographique, et ce dans un contexte de changement climatique et de propagation facilitée de maladies émergentes. Ces effets sont d’autant plus accentués en milieu restreint et souvent vulnérables comme les îles méditerranéennes.
Le projet Ressources Naturelles caractérise et valorise des substances naturelles végétales et spécifiques sur lesquelles peut s'appuyer une activité humaine durable. Nous nous intéressons particulièrement à deux domaines: les Plantes à parfum Aromatiques et Médicinales (PAM) et les produits agroalimentaires patrimoniaux (huile d’olive, agrumes, miels…..).
Pour la période 2017-2022, notre groupe est constitué en trois équipes. L'équipe Chimie des Produits Naturels (CPN) et l'équipe de biochimie sont localisées à Corte sur le campus Grimaldi. L'équipe de Chimie-Biomasse est localisée à Ajaccio sur le site expérimentale Georges Peri. La cohérence de notre thématique, notre positionnement national et international et notre ambition de continuer à augmenter les facteurs d’impact de nos publications nous ont amenés à poursuivre l’action entreprise lors du précédent quadriennal. Les trois équipes continuent à travailler sur des thématiques communes avec des approches complémentaires dans les axes suivants :
PAM et autres végétaux d'intérêt en cosmétique et en pharmacie
Les mélanges issus de ressources naturelles végétales constituent des matrices analytiques particulièrement complexes pour lequel le double objectif identification/quantification des composés est particulièrement difficile à atteindre. L’accès à des données complètes et fiables constitue un premier challenge scientifique car les produits naturels se présentent, pratiquement toujours, sous forme de mélanges complexes de molécules volatiles ou non, appartenant à diverses familles chimiques (terpènes, phénylpropanoïdes, alcaloïdes, flavonoïdes, coumarines, lipides….). Dans ce domaine et fort d’une vingtaine d’années d’expériences mais aussi de bases de données efficientes et adaptées, nous possédons un incontestable savoir-faire et souhaitons poursuivre le développement de la méthode d’analyse basée sur la RMN du carbone-13 avec des applications à l’analyse d’extraits végétaux d’origine terrestre mais surtout d’origine marine. Par exemple dans le domaine des PAM, nous disposons aujourd’hui de nombreuses bibliothèques dont une particulièrement efficiente « Terpènes » qui contient les données de plus de 1100 molécules et a fait l’objet d’une protection auprès de la SATT-SE. Dans nos banques, toutes les données spectrales sont obtenues dans les mêmes conditions opératoires ce qui constitue un atout par rapport à des bibliothèques qui compilent des données issus d’acquisitions réalisées dans des conditions très variables.
Les résultats obtenus dans le cadre du projet MARINA cosmétique sur des algues du genre Laurencia montrent des compositions chimiques très intéressantes (C15 acétogénine, molécules polyhalogénées). Ces algues possèdent des spécificités dues à leur développement sur les côtes de Corse cependant leur taxonomie est mal définie et nos données analytiques fourniront des informations supplémentaires à la différentiation des espèces. Le contexte insulaire Corse joue un rôle certain sur la production d’actifs biologiques mais apparait aujourd’hui très mal connu. Nous avons donc des perspectives de développement dans le domaine de l’analyse des extraits issus des algues avec aussi la recherche d’activités biologiques et particulièrement les activités anti oxydantes et cytotoxiques pouvant trouver des applications dans le domaine des cosmétiques. En écologie chimique, nous allons développer le même type d’approche sur des interactions plantes-pollinisateurs. Nous étudierons si certaines plantes de Corse (endémiques et à large aire de distribution) ont modifié leur système de pollinisation et en particulier leurs odeurs florales (responsables du type de pollinisateur attiré) en milieu insulaire. Il est aussi envisagé de développer cette thématique de l’action des composés volatils végétaux à des modèles appliqués au milieu agricole de Corse sur des insectes ravageurs de plantes cultivées ou vecteurs de maladies (projet FEDER).
L’université de Corse s’est investie depuis plus d’une vingtaine d’années sur la caractérisation chimique des huiles essentielles mais aussi sur la mise en évidence d’activités biologiques. Ces études menées dans un cadre académique ont donné lieu à de nombreux articles et soutenances de thèse. Cependant ces données sont peu diffusées dans la profession et parfois difficilement exploitables mais sont d’une grande importance pour les professionnels qui peuvent trouver des éléments scientifiques susceptibles de soutenir les allégations et plus généralement leur communication. La rédaction d’un ouvrage regroupant les données chimiques, biochimiques et biologiques constitue une action attendue par les partenaires privés que l’université se doit d’accompagner. Il s’agira ainsi de fournir aux professionnels de la filière cosmétiques installés en Corse des données scientifiques fiables afin de soutenir les allégations utilisées dans leurs préparations.
L'équipe CPN développe et adapte des outils bio-informatiques, reposant sur des algorithmes statistiques facilitant l’annotation et la comparaison des analyses par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) pour l’étude de petites molécules. Les résultats sont interprétés graphiquement sous la forme de réseaux de similarité spectrale. La puissance des réseaux moléculaires réside dans leur capacité à organiser les données MS/MS, y compris sans connaissance préalable sur l’échantillon (absence de constituants de référence). Le développement de ces outils nécessitera la mise en place de méthodologies fiables et performantes pour l’identification et la quantification des métabolites secondaires contenus dans les ressources végétales. Ces études nécessiteront la mise en place de base de données sur les molécules ciblées (composés terpéniques et phénoliques d’intérêt).
Compréhension de mécanismes d'action de molécules issues d'huiles essentielles
Notre objectif est de continuer les travaux déjà entrepris en s’orientant sur une étude plus approfondie des mécanismes d’action. Afin d’identifier les cibles cellulaires des principes actifs isolés à partir de l’ensemble des produits naturels testés, des études sur la membrane et/ou la paroi bactérienne seront mises en place. Nous envisageons pour cela d’évaluer la dépolarisation membranaire (fuite d’ions potassium), ainsi que la modification de la perméabilité membranaire (fuite d’ATP, relargarge de matériel cytoplasmique). Des études en microscopie électronique à transmission viendront compléter la compréhension des mécanismes mis en jeu en rendant compte des aspects cytomorphologiques. L’ensemble des données chimiques et microbiologiques nous a permis de montrer que l’activité des produits testés dépend, non seulement des différentes familles de molécules qui entrent dans leur composition, mais également des interactions de synergie, qui peuvent s’établir entre elles. Des essais de synergie devront donc être envisagés dans le but d’optimiser les objectifs visés pour la formulation de désinfectants à base d’huiles essentielles.
L’identification des motifs structuraux essentiels à l’activité anti-efflux des dérivés du géraniol, soulève la question de leur mode d’action sur la pompe AcrAB-TolC d’E. aerogenes EA289. De fait, une meilleure caractérisation des différentes sous-unités de la pompe permettra de préciser leur mode d’interaction avec les différents substrats sélectionnés. Des études de fixation de ces molécules ont été mises en place par « quenching de fluorescence » sur la sous-unité AcrB de la pompe. Par ailleurs, la compréhension du mécanisme d’inhibition global de la pompe d’efflux pourra être étudiée sur des systèmes reconstitués. Tout d’abord une approche par pontage covalent in vitro sera entreprise. Par la suite l’intégration de la pompe AcrAB-TolC dans des protéoliposomes permettra l’étude du système dans des conditions proches de l’organisation physiologique.
Le mode d’action des molécules impliquées dans l’inhibition du quorum-sensing devra être précisé afin d’identifier la ou les cible(s) principales. Cette étude fait appel tout d’abord à la mise au point d’une méthode d’extraction des AHL synthétisées par la bactérie en présence et/ou en absence des produits testés. Ces AHL seront par la suite identifiées et quantifiées par une méthode de chimie analytique (CPG-SM) dont les conditions expérimentales sont encore à définir. La réponse apportée en amont par ces différents tests permettra d’orienter et de préciser le mécanisme biochimique impliqué dans la perturbation dans la voie de signalisation du QS : dégradation des AHL dans le milieu, inhibition de leur synthèse ou de leur fixation sur les récepteurs membranaires (thèse JP Poli).
Nous poursuivrons la caractérisation chimique et l’étude des propriétés antivirales d'Euphorbia de Corse. Nous allons étudier leur composition plus en détail, grâce à l’intégration d’outils bio-informatiques (réseaux moléculaires), à des méthodes utilisant la LC-MSn, mais aussi grâce aux nouvelles possibilités de couplage en ligne (comme la spectrométrie à mobilité ionique) et hors-ligne (RMN), (thèse M Esposito).
Compréhension des mécanismes moléculaires
Sous titre complet : Compréhension des mécanismes moléculaires régissant la régio- et la stéréo-spécificité des enzymes de la voie de la lipoxygénase et production de molécules à haute valeur ajoutée (molécules aromatisantes et composés bifonctionnalisés).
Nous poursuivrons les travaux concernant la compréhension des mécanismes moléculaires régissant la régio- et la stéréo-spécificité de la lipoxygénase et de l’hydroperoxyde lyase d’olive. Les résultats nous ont permis de formuler une hypothèse expliquant le mécanisme catalytique de la LOX1 d’olive, dans lequel le substrat pénètrerait dans le site actif par son extrémité carboxylate. Il serait intéressant à présent de modifier le résidu chargé positivement (arginine 733) du fond du site actif de l’enzyme afin de vérifier s’il interagit avec l’extrémité carboxylate du substrat. Il pourrait être également intéressant d’utiliser comme substrat un acide linoléique contenant un atome de deutérium à la place d’un atome d’hydrogène sur le carbone 11. Ce substrat pourrait permettre de vérifier si le même hydrogène du carbone 11 est arraché par l’enzyme lors de la formation du 9-hydroperoxyde et du 13-hydroperoxyde. Un effet sur les paramètres cinétiques mesurés, par rapport au substrat non deutéré, impliquerait l’abstraction du deutérium. Lors d’une analyse par spectrométrie de masse des hydroperoxydes formés, les ions spécifiques seraient facilement identifiables. Ces études permettraient de conforter notre hypothèse sur le mécanisme catalytique de la LOX1 d’olive. Nous allons également poursuivre notre étude sur l’hydroperoxyde lyase d’olive. Nous allons terminer la caractérisation biochimique du mutant T302K ainsi que des doubles mutants T302K/D218T et T302K/Q187D et du triple mutant T302K/Q187D/ D218T. Les résultats devraient nous renseigner sur le rôle joué par ces résidus dans le mécanisme catalytique de l’HPL d’olive. Des études de docking et de dynamique moléculaire en collaboration avec le Dr Isabelle André (LISBM-UMR 5504, Toulouse) devraient également être réalisées. Ces études devraient nous permettre de mieux comprendre le mécanisme catalytique de l’enzyme et de préciser les résidus impliqués dans ce mécanisme.
Nous allons poursuivre le second axe de recherche concernant le développement de procédés biotechnologiques de production de molécules aromatisantes (comme les molécules à note verte) à haute valeur ajoutée intéressant les secteurs cosmétique et alimentaire. Nous allons nous intéresser au procédé complet en étudiant l’utilisation simultanée, en combinaison ou séquentielle des enzymes. Le procédé sera dans un premier temps étudié à l’échelle du laboratoire puis à l’échelle semi-industrielle. Nous allons pour cela optimiser les conditions de production des enzymes recombinantes (en faisant varier les températures de pré- et post-induction, la durée d’induction, l’inducteur et les concentrations d’inducteur, en testant différents systèmes d’expression, …) afin d’obtenir des quantités d’enzymes permettant de réaliser ces études. Nous avons également développé une collaboration avec le Dr Jean-Marc Nicaud (INRA, UMR1319, Jouy-en-Josas) pour produire une levure Yarrowia lipolytica exprimant une 13-LOX et une 13-HPL d’olive. L’utilisation d’une telle levure dans un procédé biotechnologique de production de molécules à note verte va être étudiée. Nous allons également nous intéresser aux méthodes de récupération des molécules à note verte produites dans de tels procédés. Différentes méthodes (extractions liquide-liquide par différents solvants, entrainement par un flux gazeux puis piégeage des molécules …) vont être testées en collaboration avec les équipes de chimie du projet RN.
Enfin, nous envisageons de développer des procédés biotechnologiques de production de composés bifonctionnalisés, qui sont structurellement bien adaptés à la synthèse de biopolymères et/ou de biolubrifiants.
Nous allons également nous intéresser au transfert de la mise en œuvre des procédés biotechnologiques depuis le stade laboratoire jusqu’à une échelle pilote
Etude des stratégies physiologiques et biochimiques
Sous titre complet : Etude des stratégies physiologiques et biochimiques pour lutter contre les stress environnementaux des agrumes.
Dans un premier temps, nous souhaiterions faire évoluer la thématique sur les mécanismes biochimiques impliqués dans la tolérance au stress en étudiant le rôle que pourraient jouer les autres organes de la plante, et notamment le système racinaire. En effet, des études récentes tendent à montrer que le complexe racinaire peut conditionner à lui seul la tolérance au stress chez une espèce. Par exemple, des expérimentations menées par l’UMR AGAP du CIRAD ont montré que le mandarinier Cléopâtre (C. reshni), lorsqu’il est sur ses propres racines, tolère de très fortes concentrations en sel, c’est-à-dire qu’aucune nécrose n’apparait au niveau des feuilles. En revanche, si l’on s’affranchit du compartiment racinaire, comme c’est le cas lors d’un greffage, différents symptômes foliaires apparaissent comme des chloroses et des nécroses. Il semble donc probable que ce dernier possède d’importants mécanismes racinaires de détoxication lui permettant d’éviter l’apparition d’un stress oxydatif trop prononcé. Cette nouvelle approche pourrait d’ailleurs être intégrée dans la thématique plus large que développe actuellement le laboratoire de biochimie, en étroite collaboration avec le CIRAD de Montpellier et l’INRA de Corse, portant sur l’amélioration de la tolérance des agrumes aux contraintes environnementales, et notamment les contraintes liées à un déficit hydrique, au froid ou à une carence nutritionnelle qui sont les principales rencontrées en Corse. Toutes les contraintes environnementales se traduisant par un stress oxydatif au niveau cellulaire, le développement de ces nouvelles études passe donc par l’identification et la sélection de porte-greffes conférant une meilleure tolérance à une ou plusieurs de ces contraintes. Actuellement, l’une des pistes les prometteuses pour augmenter la tolérance des agrumes au stress oxydatif est le recours à l’utilisation de porte-greffes tétraploïdes (4x), c’est-à-dire présentant un doublement du nombre de chromosomes par rapport à leurs homologues, majoritairement diploïdes (2x). En effet, il a d’ores et déjà été mis en évidence une tolérance accrue au stress salin et au déficit hydrique chez certains de ces porte-greffes d’agrumes de même qu’une meilleure adaptation des plantes polyploïdes à des périodes de froid drastiques. Ce travail consisterait donc à caractériser les mécanismes de défense antioxydants et à quantifier les indicateurs d’oxydation au niveau des feuilles et des racines de différentes combinaisons de porte-greffes 4x afin de sélectionner les plus résistants au stress. Par la suite, pour compléter cette étude, nous pourrons aussi vérifier si l’utilisation de tels porte-greffes confère un gain de tolérance à des variétés greffées sur ces derniers comme, par exemple, le clémentinier qui est le produit phare de l’agrumiculture en Corse.
Dans le cadre du précédent contrat, nous avons aussi précisé l’effet de certains déterminants physiologiques, génétiques et biochimiques sur la teneur en sucres, l’acidité et la fragrance mandarine « Commune » qui sont des composantes essentielles de la qualité des clémentines et mandarines. Ce travail sera poursuivi par l’analyse de deux populations, une diploïde et une triploïde, issus des mêmes parents. Des stress thermiques (naturels ou imposés) et hydriques seront appliqués sur ces deux populations. Les individus élites triploïdes, présélectionnés comme ayant un fort intérêt pour la Corse, et leurs parents seront testés plus finement dans ces conditions de stress abiotiques. Ces génotypes seront comparés en déterminant trois paramètres physiologiques indicateurs du niveau de stress (la capacité photosynthétique, la conductance stomatique et la fluorescence chlorophyllienne) et les concentrations de deux marqueurs d’oxydation des cellules du végétal (malondialdéhyde, peroxyde d’hydrogène). Les paramètres biochimiques révélant les capacités de défense de la plante seront ensuite étudiés au niveau enzymatique (superoxyde dismutase, catalase...) et non-enzymatique (ascorbate et glutathion).
Par ailleurs, dans la perspective de création de produits innovants, l’étude de certains métabolites secondaires clés de la valeur organoleptique et santé (composés aromatiques, huiles essentielles, flavonoïdes, furanocoumarines, anthocyanes) sera réalisée finement en coopération avec les équipes de chimie du projet RN. Les déterminants génétiques de certaines voies métaboliques impliquées dans la qualité des fruits (sucres, acides, composés phénoliques, caroténoïdes) seront également étudiés en collaboration avec l’UMR AGAP Corse. Des populations d’hybrides diploïdes et triploïdes de mandariniers, de pomelos et de limettiers, comprenant des individus élites pour l’agrumiculture Corse, seront finement phénotypées.
Responsable du Projet RN : PR Liliane Berti (berti_l@univ-corse.fr)